FISH技術(shù):熒光標(biāo)記的原位雜交技術(shù)
1974年Evans將染色體顯帶技術(shù)和染色體原位雜交聯(lián)合應(yīng)用,提高了定位的準(zhǔn)確性。20世紀(jì)70年代后期人們開始探討熒光標(biāo)記的原位雜交,即FISH技術(shù)。1981年Harper成功地將單拷貝的DNA序列定位到G顯帶標(biāo)本上,標(biāo)志著染色體定位技術(shù)取得了重要進(jìn)展。20世紀(jì)90年代,隨著人類基因組計劃的進(jìn)行,由于繪制高分辨人類基因組圖譜的需要,F(xiàn)ISH技術(shù)得到了迅速的發(fā)展和廣泛應(yīng)用。
1.原理
將核酸探針的某一種核苷酸標(biāo)記上報告分子如生物素、地高辛,可利用該報告分子與熒光素標(biāo)記的特異親和素之間的免疫化學(xué)反應(yīng),經(jīng)熒光檢測體系在鏡下對待測DNA進(jìn)行定性、定量或相對定位分析。
肺腫瘤細(xì)胞FISH
2.實(shí)驗(yàn)流程
FISH樣本的制備→探針的制備→探針標(biāo)記→雜交→染色體顯帶→熒光顯微鏡檢測→結(jié)果分析。
3.特點(diǎn)
原位雜交的探針按標(biāo)記分子類型分為放射性標(biāo)記和非放射性標(biāo)記。用同位素標(biāo)記的放射性探針優(yōu)勢在于對制備樣品的要求不高,可以通過延長曝光時間加強(qiáng)信號強(qiáng)度,故較靈敏。缺點(diǎn)是探針不穩(wěn)定、自顯影時間長、放射線的散射使得空間分辨率不高、及同位素操作較繁瑣等。采用熒光標(biāo)記系統(tǒng)則可克服這些不足,這就是FISH技術(shù)。FISH技術(shù)作為非放射性檢測體系,具有以下優(yōu)點(diǎn):1、熒光試劑和探針經(jīng)濟(jì)、安全;2、探針穩(wěn)定,一次標(biāo)記后可在兩年內(nèi)使用;3、實(shí)驗(yàn)周期短、能迅速得到結(jié)果、特異性好、定位準(zhǔn)確;4、FISH可定位長度在1kb的DNA序列,其靈敏度與放射性探針相當(dāng);5、多色FISH通過在同一個核中顯示不同的顏色可同時檢測多種序列;6、既可以在玻片上顯示中期染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)的變化,也可以在懸液中顯示間期染色體DNA的結(jié)構(gòu)。
缺點(diǎn):不能達(dá)到100%雜交,特別是在應(yīng)用較短的cDNA探針時效率明顯下降。
4.應(yīng)用
該技術(shù)不但可用于已知基因或序列的染色體定位,而且也可用于未克隆基因或遺傳標(biāo)記及染色體畸變的研究。在基因定性、定量、整合、表達(dá)等方面的研究中頗具優(yōu)勢。
根生實(shí)驗(yàn)流程
一、探針及標(biāo)本的變性
(1)探針變性:將探針在75℃怛溫水浴中溫育5min,立即置0℃,5~10min,使雙鏈DNA探針變性。
(2)標(biāo)本變性:
①將制備好的染色體玻片標(biāo)本于50℃培養(yǎng)箱中烤片2~3h。(經(jīng)Giemsa染色的標(biāo)本需預(yù)先在固定液中退色后再烤片)。
②取出玻片標(biāo)本,將其浸在70~75℃的體積分?jǐn)?shù)70%甲酰胺/2×SSC的變性液中變性2~3min。
③立即按順序?qū)?biāo)本經(jīng)體積分?jǐn)?shù)70%、體積分?jǐn)?shù)90%和體積分?jǐn)?shù)100%冰乙醇系列脫水,每次5min,然后空氣干燥。
二、雜交:
將已變性或預(yù)退火的DNA探針10mL滴于已變性并脫水的玻片標(biāo)本上,蓋上18×18蓋玻片,用Parafilm封片,置于源潮濕暗盒中37℃要交過夜(約15~17h)。由于雜交液較少,而且雜交溫度較高,持續(xù)時間又長,因此為了保持標(biāo)本的濕潤狀態(tài),此過程在濕盒中進(jìn)行。
三、洗脫:此步驟有助于除去非特異性結(jié)合的探針,從而降低本底。
(1)雜交次日,將標(biāo)本從37℃溫箱中取出,用刀片輕輕將蓋玻片揭掉。
(2)將已雜交的玻片標(biāo)本放置于已預(yù)熱42~50℃的體積分?jǐn)?shù)50%甲酰胺/2×SSC中洗滌3次,每次5min。
(3)在已預(yù)熱42~50℃的1×SSC中洗滌3次,每次5min。
(4)在室溫下,將玻片標(biāo)本2×SSC中輕洗一下。
四、雜交信號的放大:
(1)在玻片的雜交部位加150mL封閉液I,用保鮮膜覆蓋,37℃溫育20min。
(2)去掉保鮮膜,再加150mL avidin-FITC于標(biāo)本上,用保鮮膜覆蓋,37℃繼續(xù)溫育40min。
(3)取出標(biāo)本,將其放入已預(yù)熱42~50℃的洗脫液中洗滌3次,每次5min。
(4)在玻片標(biāo)本的雜交部位加150mL封閉液II,覆蓋保鮮膜,37℃溫育20min。
(5)去掉保鮮膜,加150mL antiavidin于標(biāo)本上,覆蓋新的保鮮膜,37℃溫育40min。
(6)取出標(biāo)本,將其放入已預(yù)熱42~50℃的新洗脫液中,洗滌3次,每次5min。
(7)重復(fù)步驟(1)、(2)、(3),再于2×SSC中室溫清洗一下。
(8)取出玻片,自然干燥。
(9)取200mL PI/antifade染液滴加在玻片標(biāo)本上,蓋上蓋玻片。
五、封片:
六、熒光顯微鏡觀察FISH結(jié)果:
先在可見光源下找到具有細(xì)胞分裂相的視野,然后打開熒光激發(fā)光源,F(xiàn)ITC的激發(fā)波長為490nm。細(xì)胞被PI染成紅色,而經(jīng)FITC標(biāo)記的探針的探針?biāo)谖恢冒l(fā)出綠色熒光。由于本實(shí)驗(yàn)使用的是Y染色體上的特異序列,因此在男性外周血染色體標(biāo)本的雜交中呈陽性,即使在末分裂的細(xì)胞中,也可以觀察到明顯的雜交信號。照相記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果
電話
微信掃一掃